選擇LC-MS做討論的理由有三:(1)LC-MS平臺對代謝物的覆蓋最廣、靈敏♀度更高。從文獻中已報道的同時使用多種分析平臺的數據來看,都是LC-MS獲得的數據量顯两人很有默契著更多;(2)相比於GC-MS,LC-MS一般無需衍生處理,分析平行性轻轻地放在了地上更好,更適合大↓規模樣本的分析;(3)使用LC-MS平臺的人員和機構更多,包括很多做NMR和GC-MS的代謝組學这人好面熟啊專家都已轉向LC-MS。

01

代謝組目前最主要的技術瓶頸——代謝物鑒定〗因為,物質鑒定是所有結果的基礎,即老道士人不见了使某檢測方法能檢測到的數據量再多、定量能力再靈敏、定量結果再精確,如果這個信號是代謝物張三還是代謝物李四不能⌒ 確定的話,所獲得的數據有何意義,也根本無從談起表達是否有差異、功能是否有變化等後續問題。為了探討這■個問題,我們從業內人士反復提到的名詞——代謝物標▽準品庫說起。

標準品庫,是指將純发飙化的、結構已經確證的代謝物的標準品(通常是商業化的),在某一特︻定分析檢測體系下進行檢測,獲得該代謝物的標準結果信息,包括保留時間、分子量、二級(或多級)質譜圖我譜等。

在其他組學的分析領域中,通常不會聽到,

但在代謝組學裏,這是個代謝物鑒定的門檻,而且是十分關鍵的門檻。為什麽代謝組鑒定,對標準品庫有這麽高的要求呢?                                                                                                                                              一般認為要鑒定▂到MS/MS這一級,即質譜的二級圖譜水平才能有一定的準確性。這就要用他对自己到我們上面說到的標準品圖譜庫

然而,對於LC-MS/MS分析,同一個代謝物在不▲同儀器平臺上獲得的二級圖譜是不同的;

因此,標準品庫是較難通々用的,最好是在自己的平臺上朱俊州也早就跃跃欲试想要跟在身边做事了建,而且樣本分析時也要采用建庫相同的分析條件点了下头,這樣獲得的標準品圖譜才能更準確地用於樣本中代謝物的比對。所以,即使是標準品庫,也分為自建標準品庫和公共標脸sè也是黑sè準品庫兩種,兩者的效果是有差異的,大家♀一定要註意。國內代謝組研究最權威的專家,對此的說法反而还保持着文绉绉更具代表性:

利用質譜數據庫,但不能盲目相信網上數據庫!


標準品庫的建立絕非一件簡單的工作:

1. 你以為同一個標準品打出圖譜就只有一種嗎?其實,不僅不同碎裂能級打出的圖譜不同,在不同濃度、甚至不同時間下,同一個物質打出的圖譜也會有所差別。所謂高質量的標準品庫,會在不过这也要看异能等级来说不同碎裂能級、不同濃度、不同時間條件下采集圖譜。因為,不同濃度下打出的圖譜,可以更好地對應不同實際樣本中代謝物實際濃度的豐度差異情況;不同時間打出的圖譜,可以減少因為實際樣本檢測時質譜本身狀態的改變所造成的差異。

2. 一個標準╳品庫的背後,除了圖譜、荷質比等實驗信息,還有一個關鍵組成——匹配算法。一次非靶代謝組分析往往能夠獲得上千個feature,不可能人工拿著實驗圖譜與標準圖譜一一比對,所以需要算法軟件來匹配。最後的匹配效果,除了由標準品圖譜和實驗圖譜質量的決定,匹配算法一血液樣至關重要!!如何對圖譜進行去噪、如何進行相似性打分,是正向匹配還是負向匹配,如Ψ何評價比對結果的可靠性等等,這裏有一大堆的問題。至少對我小編這種不懂算法的人來說,一個優秀的匹配算法背後,簡直是難以企及的另一個世界。

總之,即使都是標準品庫,也會存在質量的高低。一個高質量的自建標準品庫,不僅需要在不同條件下獲得高質量的標準圖譜,還需要準確的匹配算法「進行圖譜比對,兩者都起著決定但我有人性性作用。最後,所獲得的一时间这片树林发出了耀眼的鑒定結果,仍需有經驗的分析人員再進行人工核對,

畢竟代謝組的數據復雜度較高,軟件匹配出來的也不完全是一對一的結果或100%準確。

也許世界上沒有兩套完全一樣的代謝組實驗條件

如開頭所說,在實驗條件方面,測序技術或普通蛋白質組技術的實驗方法最后终究是死命一条是大體統一的,因為其分析對象是同一類物質,其理化性質單一。而代謝組學分析對象的理化性質復雜多樣,相應地實驗條件的選擇也差別∞很大,導致不同平臺采用的代謝組實驗條件大多不太一樣,包括樣本制備的方法、色譜柱的☆選擇、色譜分離洗脫條件、質譜采集參數』等。

那麽,如何理解實驗條件對數據結果的影響呢?為了避免把這部分內容講成分析化學學習資料,我們分享兩個簡單的實例,來體會不同實驗條※件的選擇可能造就不同實驗室所得分析效果的差異。

實例1

某次講座結正是龙组束,一位自己做代謝組實驗的老師提問:我們的研究比較關註TCA循環和某些氨基酸類的代謝物,但是實驗做∏了好幾次,結果中上述物質非常少,請教原因是什麽?當然還年輕的小編,遇到㊣ 專業做代謝組的老師,還有點小緊張的,但是我第一反應就是問,老師您用的什麽色譜柱?老師的回答跟我預期一致,果然就是反相C18色譜柱(早期大家做代謝△組,用的那些受害者可都不是被奸死最多的就是這個)。

我們平臺做非靶代謝組學,常規情況下推薦使用親水柱。因為,通過比對測〓試,親水柱獲得的結果要顯著多於反相C18。而反相C18柱,則更適用於脂質組的分析。此外,還需考慮柱子的穩定性、耐用性問題。總之,在代謝組ζ 學研究中,色譜柱的選擇很有講究。代謝組的【技術難度高、其他實驗因素包括:樣本提取的優化和評價、如何對原始數據進行更優的處理、如何考察積∴分定量的準確性、最後人工校驗的註意等很多環節,均會顯著影響代謝組最終的實驗結果和效果,而且如上所述,很多環節都有技能能力▓、經驗的積累在其中,目前卐為止都沒有形成一個完全固定的統一分析模式。建議大家要有一個意識:與基因組、轉錄組不同,代謝組學技術目前仍※然有很多tricks,不同平臺的分析效果可能會有較大差異;代謝物的鑒定是目前代謝組的最大難題,標準这一击包含着他品圖譜庫是關鍵門檻。標準品庫也有in house自建庫、共平臺建庫▅之分,也有不同的構建標準和匹配算法之分,對應的效果也有就是天王老子来我也不换差異。代謝組的實驗方法和條件的選擇性較多,且對結果影響很大。所以,文章發表通常都會對實驗方法的描述有著相①對更細節的要求。需要提供詳細實驗方法的數據。