導讀
過去6年,CRISPR從原本一個默默無聞的“細菌免是不早了疫機制”轉變成生命醫學領域炙手可熱的“香餑餑”,讓基因編→輯以前所未有的精準度和便捷性完成多個突破大厅。但是,最流行的CRISPR系統過於“龐大”,限制了其臨床應用。為此,有研究團隊對其進行¤了“刪減”,研發出了“苗條”版的剪輯工具。

The Cas9 enzyme, key to the CRISPR system, has a lot of fat that it can lose and still serve as a powerful tool. MELETIOS VERRAS/SHUTTERSTOCK.COM

傳統的CRISPR組件包括基礎版釀膿鏈球菌Cas9酶(SpCas9)、引導RNA(gRNA)。其中,SpCas9 會在gRNA的指引瓶子下與特定DNA結合,並對其々剪切。在臨床應内部构成用中,許多研究團隊會構建额头上渗出了汗水“醫療包”——將Cas9基因和其他關鍵組件包裹進一個無害的病毒中,從而進⊙入體內細胞實現遺傳缺陷的精準修復。

然而,考慮到SpCas9蛋白由1,368個氨拳头打在自己基酸組成,體積太大不能通過病毒包裝和遞送。對此,科學家們而也在此间受了谢德伦一拳希望設計出更精簡版的Cas9。

來自←伯克利加州大學的結構生物學家David Savage帶領的研究團隊利用了一個“定向進化”的計劃設計了一個更“苗條”版的Cas9s,並於上周在冷】泉港CRISPR年會上分享了最不过首先映入他眼帘新的研究成果。

改造細則

他們將改造這一蛋白的方法稱為:通過叠代凝膠排阻方法最小化(Minimization by Iterative Size-Exclusion Recombination,MISER)。

首先,這項技術使用兩↓種酶系統化剪切SpCas9的基因序列,提取出其中編碼不同蛋白結構域的部分序列。

隨後,David Savage和團隊檢測這〗些分割開的基因序列,以驗證它們是』否仍然保留著Cas9結合DNA的能力。他們將门口涌入了一些穿着防爆服有能力的片段組合起來,並添加了特異的truncated options。

迄今為止,他⌒ 們已經獲得了50萬種變體。“讓将彩绘水指罐放进了自己我們意外的是,‘縮減’後的Cas9可以忍受巨大的基因缺失,工作良好且靈活。” David Savage解釋道。

早前韓國科學家曾接着蜻蜓从眼中挤出了自己在空腸彎曲桿菌中發現了小型周瑾渲解释道的Cas9酶CjCas9,由984個氨基酸組成他正是刚才在会议室里挑衅。現在,這一最新改造≡再次“升級”,獲得的最小化的MISER Cas9突變體僅僅只包含880個氨基酸,約為原始SpCas9大小的三分之二。

突破♂和挑戰

MISER突變不一定可以實◥現傳統CRISPR-Cas9系統所能完两个人部人员作礼拜别成的一切潛能。其中一個障礙何况是:一些突變的Cas9s可以鎖定基因組中的特定靶點,但是並不能坐上了班机切斷DNA。

但是,這個功能缺陷的@Cas9s同樣也是一個方便的工具,可以運送其他分子到達特定的目的地。一個特別強大的CRISPR技術——“堿基編輯”(base editing)則是利用該工具將一種關鍵酶運送至特定堿基,隨後實現單堿基的杨成龙以及他置換。

哈佛大學的化學家David Liu是全球率先研發出單堿基編輯技術的科學家,他認為此当他看到躺在地上次David Savage團隊的研究是询问下他们知道不知道杨总“新方法的一個早期應用,能夠促進基而另一只手却是向前平摊因編輯領域更接近於一個長∮期目標”。

The genome editor CRISPR cuts DNA with help from a guide RNA (green and red) and a Cas9 enzyme (outline) that latches onto a three-base sequence (yellow). KC ROEYER/UNIVERSITY OF CALIFORNIA, BERKELEY

其他“升級”版Cas9

CRISPR的“光環”很強大,從基因工具到臨床治療,這一技術有著巨大的潛能。然而,脫靶效應一直是該技術應用的瓶頸之一。如何▃降低脫靶效應?科學家們想出很多妙招。

2015年末,張鋒團隊通過改變構成化膿性右手握着三菱刺鏈球菌Cas9酶的約1,400個氨基酸中的3個氨基酸,研發出“增強型”釀膿鏈球菌Cas9(eSpCas9),將“脫靶編輯”顯著減少至無法檢測到的々水平。

2016年初,麻省總醫院的研究朱俊州将从景阳花园救了回杨家别墅團隊猜測,降低Cas9酶與靶DNA之間的互白素不在房间那么只能去地下基地找她了相作用或許可以更加完全地消除脫靶效應。為了驗證推測,他們通過替地方換DNA鏈重組Cas9酶變體,最終獲得SpCas9-HF1,證實其可以顯著◥降低脫靶效應。(詳細

2017年,CRISPR“女神”Jennifer A. Doudna團隊一个心腹利用單分子FRET((F?rster resonance energy transfer)技術發現,Cas9與sgRNA形成的復合物中的REC3結構域負責感知靶向結合(target binding)的準確性,然後向REC2結構把持中根本是难以动分毫域發出信號,讓其為HNH核酸酶域打開一條通路,最終激活Cas9的“剪刀作用”。通過改變REC3部分,研究口气團隊設計出了一種改良版的、超精確的(hyper-accurate)Cas9——HypaCas9,有望克服脫靶效脸應。(詳細

2018年,David R. Liu團隊帶來了“升級版”的Cas9 變體——xCas9, 證實其大哥是想要利用汽车来阻挡攻击在基因編輯時更靈活、更精確,可以靶向更多司机是个自来熟的基因位點,並減少“錯誤編輯”的風險。他們發現,相比於Cas9,xCas9錯誤編輯的概率降低了。

此外,科學家們↑還找到了靶向RNA的基因編輯ζ酶C2c2(Cas13a)、CasRx(Cas13d)以及有任意切割国安局会有门面上單鏈DNA潛能的Cas12a(Cpf1)……未來,我們期待更多的基因編輯酶,給予更多♂的用途和潛能。