生物制藥的各種生產細胞系研發,通常需要從異質性細胞群體開始,分選並建立單細胞克隆。許多監管指南都╲要求生產細胞系必須是單克隆性ㄨ的,並且需要實際體內性的證明。因此,制藥公司就開№始了技術的研究。Boehringer Ingelheim GmbH & Co. KG的技術人員在文中描述的方法其實並不復雜:

1、利用卐流式細胞術分選單個活細胞,原理就是在FSC/SSC散點圖上,選↑擇狀態好的核心細胞(如下圖最左側),然後再依次卐通過FSC-A/FSC-W、SSC-A/SSC-W,選擇出單個活細可以說是百利而無一害胞。

2、光這樣排除單個細胞黑熊王還不夠,將細胞◤對半分,一半染CFSE Green、一半染Cell Tracker Orange,然後以1:1混合後共落井下石培養過夜,上流⊙式分選,於是就出現下面這樣的圖。下圖中,從左到右、從上到下,依次是:未染色組、單染Cell Tracker Orange、單染CFSE Grenn、雙染。在雙染組,只有左上象限和右下象限單染的∞細胞才是←單個細胞,用點了點頭流式分選儀分選這兩個象限的細胞。

不考慮原來培養物的粘連率或活【性,這個方法獲取的單○細胞非常純,純度大約99.8%。

3、這樣分出單細胞還不夠。作者以1000×g離心3分鐘獲得最佳活性的細胞,然後以〖最佳濃度的Calcein AM標記細胞(約5uM),這個濃度既可保證良好染色,又可使¤得細胞活力最好。接著用亮⌒ 場顯微鏡和自動熒光成像,再結七十億合人眼確認,能夠識別出☆99.82%的分選後粘連細胞(漏網之魚),進一步保證了單細胞純度。

4、最後進行克隆性驗證,通過前面兩種方式轟的層層保障,最後的單細胞克隆概率接近99.999%。

讀了※這篇文獻之後,得到的體會是,無論他心中也是暗暗道是否制藥行業,如果哪位FLOWER需要分選出好的單細胞,可以參考他們這種方式,具體的方法和步驟請々點擊『閱讀原文』。